Estructura de un nucleosoma

Nature Communications volumen 13, número de artículo: 5075 (2022) Citar este artículo

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Se publicó una corrección del autor de este artículo el 19 de enero de 2023.

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Los genes que codifican la maquinaria central del ciclo celular están regulados transcripcionalmente por la familia MuvB de complejos proteicos de una manera específica del ciclo celular. Los complejos de MuvB con los factores de transcripción B-MYB y FOXM1 activan genes mitóticos durante la proliferación celular. Los mecanismos de regulación transcripcional de estos complejos aún están poco caracterizados. Aquí, combinamos el análisis bioquímico y la reconstitución in vitro, con el análisis estructural mediante microscopía crioelectrónica y espectrometría de masas de reticulación, para examinar funcionalmente estos complejos. Encontramos que el complejo MuvB:B-MYB se une y remodela los nucleosomas, exponiendo así el ADN nucleosomal. Esta actividad de remodelación está respaldada por B-MYB, que se une directamente al ADN remodelado. Dada la actividad remodeladora del nucleosoma, proponemos que el complejo MuvB:B-MYB funcione como un complejo de factores de transcripción pionero. En este trabajo, racionalizamos estudios bioquímicos y celulares previos y proporcionamos un marco molecular de interacciones en un complejo proteico que es clave para la regulación del ciclo celular.

Durante el ciclo celular, una célula replica su genoma en dos copias idénticas y coordina la segregación cromosómica con la división celular. La progresión ordenada a través de las diferentes fases del ciclo celular se basa en el oscilador quinasa-ciclina dependiente de ciclina (CDK-ciclina) que desencadena secuencialmente transiciones del ciclo celular mediante la fosforilación de objetivos específicos, incluidos los efectores posteriores del ciclo celular. La actividad oscilante de las CDK-ciclinas se logra mediante la ubiquitinación, fosforilación y regulación transcripcional de proteínas específicas del ciclo celular1,2.

La transcripción de genes del ciclo celular dependiente del ciclo celular está controlada por la familia MuvB de reguladores transcripcionales3,4,5. El complejo central MuvB consta de una subunidad de andamiaje principal llamada LIN9, la proteína de unión a histonas RbBP4, la proteína de unión a ADN LIN54 y las subunidades más pequeñas LIN37 y LIN526. El dominio de unión al ADN de LIN54 recluta MuvB en sus genes diana en una secuencia específica denominada región de homología del ciclo celular (CHR)7,8. Los promotores objetivo de MuvB no tienen TATA y el CHR está ubicado directamente aguas arriba del sitio de inicio de la transcripción (TSS) y el nucleosoma +18,9. La presencia del nucleosoma +1 genera una barrera para el ensamblaje del aparato transcripcional basal10, y su posicionamiento y dinámica están finamente regulados para definir el estado transcripcional de cada gen. Aunque los mecanismos de regulación del nucleosoma +1 no se comprenden completamente y son objeto de intensas investigaciones11, la ubicación del CHR y varios estudios7,9,12 sugieren que los complejos MuvB, que desempeñan funciones activadoras y represivas, pueden ser involucrados en este proceso.

Durante la salida del ciclo celular en reposo y senescencia, también conocida como G0, el complejo MuvB interactúa con una proteína similar al retinoblastoma, formando así el complejo DREAM3,4,13, que media la represión transcripcional de aproximadamente 1000 genes del ciclo celular6. El reconocimiento de los genes diana por el complejo DREAM es combinatorio, ya que implica la unión de un CHR y un elemento dependiente del ciclo celular (CDE) aguas arriba2,14,15.

Cuando la célula se compromete a dividirse, la creciente actividad de CDK2-cilin D y E en la transición G1-S promueve la hiperfosforilación de las proteínas similares al retionoblastoma16,17, provocando así el desensamblaje de DREAM y el reingreso al ciclo celular16,18 ,19. El complejo central MuvB unido a CHR restante se asocia secuencialmente con los factores de transcripción (TF) B-MYB y FOXM1 durante la fase S20. B-MYB y FOXM1 son oncogenes y están sobreexpresados ​​en varios tipos de cáncer21,22,23,24. Se requiere el ensamblaje secuencial de B-MYB y FOXM1 en el complejo MuvB en los elementos CHR para desencadenar la activación transcripcional del programa del gen mitótico en la fase G220,25,26. Es importante destacar que el complejo de B-MYB y MuvB (MMB) es necesario para el reclutamiento de FOXM1 en los genes del ciclo celular, por lo que B-MYB se ha definido como un TF pionero para la transcripción dependiente del ciclo celular de los genes G2/M20,27.

El mecanismo molecular para la represión o activación del gen dependiente de MuvB no se conoce bien, y la estequiometría y la arquitectura general de este complejo no están claras.

La presencia de la proteína de unión a histonas RbBP4, que se comparte entre varios complejos reguladores de la cromatina2,28,29,30, sugiere que este complejo está involucrado en la regulación de la estructura de la cromatina, pero la falta de cualquier dominio ATPasa en MuvB indica que No participa en la remodelación de la cromatina dependiente de ATP. Muchos complejos reguladores de la cromatina funcionan de forma independiente del ATP. Por ejemplo, el complejo represivo 1 de Polycomb (PRC1) utiliza la oligomerización como parte de su mecanismo inhibidor31,32,33; Los factores de transcripción pioneros establecen competencia para la expresión génica uniendo el ADN nucleosomal e iniciando la remodelación de la cromatina, exponiendo así ADN nucleosomal adicional a los TF posteriores y al aparato transcripcional34,35,36,37,38. Las chaperonas de histonas ayudan al ensamblaje y desensamblaje de los nucleosomas durante la transcripción, la replicación y la reparación del ADN39,40. Se desconoce si el complejo MuvB podría utilizar alguno de los mecanismos enumerados anteriormente para activar sus funciones reguladoras de la transcripción.

Aquí, nos propusimos investigar si MuvB utiliza uno de estos mecanismos conocidos de remodelación de la cromatina independientes de ATP o posiblemente un mecanismo no descrito previamente. Por lo tanto, determinamos una instantánea estructural de un complejo MuvB en acción mediante microscopía crioelectrónica (crio-EM), en el proceso de remodelación de un nucleosoma, y ​​definimos su estequiometría, ensamblaje y unión a cromatina. En conjunto, nuestros resultados sugieren que MMB es un factor de transcripción pionero, y derivamos un modelo según el cual su actividad de remodelación de nucleosomas podría estar contribuyendo a la activación transcripcional en el contexto de la proliferación celular.

Dada la evidencia convincente de que el complejo MuvB está involucrado en la unión del nucleosoma cerca del promotor de genes diana que contiene CHR7,9,12, decidimos intentar la reconstitución de varios complejos MuvB con el nucleosoma. Expresamos de forma recombinante todas las subunidades del complejo MuvB, incluidas LIN9, LIN37, LIN52, RbBP4 y una versión corta de LIN54 (LIN54sh) donde se eliminó el extremo N no conservado (Fig. 1a) en una expresión de baculovirus/células de insecto. sistema. Esto dio como resultado la preparación de un complejo proteico de alta pureza que eluyó en un pico agudo y simétrico en cromatografía de exclusión por tamaño (SEC) (Figura complementaria 1a).

a Esquemas que muestran dominios y regiones funcionales en las subunidades del complejo MMB representados en forma lineal. El extremo N de B-MYB que contiene un dominio de unión al ADN está desordenado en la estructura crio-EM y se representa con colores descoloridos. LIN54 se representa con líneas discontinuas para aclarar que esta proteína no estaba incluida en la estructura central del nucleosoma MMB (MMBcore): El esquema de color de la subunidad NCP utilizado en esta figura se indica para cada histona y ADN. b, c Representaciones en dibujos animados de dos vistas principales del complejo MMBcore:nucleosoma que muestran la arquitectura general del complejo. Las posiciones superhelicoidales (SHL) con respecto a la díada de nucleosoma (0) están etiquetadas en (b). También se indica la entrada y salida del ADN. La unión de MMBcore abarca tres posiciones SHL (-8 a -6).

Para analizar la interacción entre MuvB y el nucleosoma de manera específica e independientemente de la función de unión de MuvB CHR, reconstituimos un complejo MuvB que carece de LIN54, que es necesario para reconocer la secuencia de CHR. A este núcleo del subcomplejo MuvB lo llamamos MuvB (MuvBcore). MuvBcore es tan estable como el complejo MuvB completo (Figuras complementarias 1a, by 2a, b), lo que demuestra que la ausencia de LIN54 no perturba la integridad estructural de MuvB. Por lo tanto, utilizamos este complejo para probar su interacción con un nucleosoma modelo reconstituido con un ADN de 167 pares de bases (pb) que contiene la secuencia 601 Widom mediante ensayos de cambio de movilidad electroforética (EMSA). El complejo MuvBcore se une al nucleosoma cuando está presente con un exceso molar de 4 veces (Figura complementaria 2e). Como era de esperar, este complejo se une a un nucleosoma que contiene CHR con una afinidad menor que el complejo MuvB que contiene LIN54sh (Figura complementaria 2g). Es importante destacar que la afinidad de MuvBcore por un nucleosoma es mayor que por el ADN libre (Figuras complementarias 3a, b).

Para definir las subunidades que interactúan directamente con el nucleosoma y el modo de unión del complejo MuvB con respecto al nucleosoma, intentamos la reconstitución de un complejo MuvBcore:nucleosoma adecuado para el análisis estructural mediante crio-EM. El complejo de nucleosoma con MuvBcore: B-MYB (MMBcore) (Figura complementaria 2f, carriles 6 a 9) manifestó una mejor homogeneidad que los complejos de nucleosoma con MuvBcore (Figura complementaria 2e, carriles 1 a 5) y con DREAMcore (Figura complementaria 2f , carriles 1 a 5), ​​como lo muestra EMSA (Figura complementaria 2e, f). De hecho, MMBcore: la banda desplazada del nucleosoma es más nítida y definida, a diferencia de los otros complejos probados (Figuras complementarias 2e, f).

Para determinar la estructura del complejo MMBcore:nucleosoma (Fig. 1a), utilizamos el protocolo GraFix41 para minimizar el desmontaje durante la vitrificación (Fig. complementaria 3c) y recopilamos un gran conjunto de datos en un microscopio electrónico Titan Krios equipado con un contador de electrones. detector directo (ver "Métodos", Fig. complementaria 4a). La clasificación extensa en dos y tres dimensiones nos permitió resolver la estructura general del complejo MMBcore:nucleosoma altamente heterogéneo y flexible (ver "Métodos", Figuras complementarias 4, 5 y Tabla complementaria 1). Nuestra estructura muestra que una porción de MMBcore, al que llamamos MuvBTAIL, contacta con el octámero de histonas y está incrustado en el disco del nucleosoma, mientras que un módulo unido de manera flexible al que nos referimos como MuvBHEAD atraviesa el ADN de entrada al nucleosoma y se ubica en el exterior. de los giros del ADN (Fig. 1b, c). Debido a la flexibilidad del complejo, empleamos refinamientos enfocados para resolver las estructuras de MuvBHEAD y MuvBTAIL con una resolución subnanométrica y la estructura del nucleosoma en el contexto del complejo MMBcore:nucleosoma con una resolución de 3,3 Å (Película complementaria 1, Suplementaria Fig. 5, Tabla complementaria 1 y "Métodos").

Combinando nuestras reconstrucciones crio-EM del complejo MMBcore:nucleosoma con datos de espectrometría de masas de reticulación química (XL-MS) y una estructura crio-EM de alta resolución adicional del complejo apo MuvB que obtuvimos (ver a continuación y las figuras complementarias . 6–9, Tabla complementaria 1 y Datos complementarios 1), pudimos definir la arquitectura general de un complejo central MuvB con el nucleosoma (Fig. 1). Sorprendentemente, nuestra estructura revela que el nucleosoma en el complejo MMBcore:nucleosoma está remodelado. Aproximadamente 20 pares de bases del ADN nucleosomal se desvían de su conformación imperturbada y se mantienen entre los módulos MuvBHEAD y MuvBTAIL (Fig. 1b, c).

Habiendo identificado los módulos MuvBHEAD y MuvBTAIL en nuestra reconstrucción del complejo MMBcore:nucleosoma, buscamos determinar la estructura detallada de MuvB para facilitar una interpretación mecanicista del complejo unido al nucleosoma. Las mediciones de fotometría de masas del complejo MuvB purificado muestran un pico principal de alrededor de 176 kDa (Figura complementaria 1b), lo que sugiere que las cinco subunidades MuvB están presentes en una estequiometría 1:1:1:1:1 en este complejo. Curiosamente, una porción menor del complejo muestra un peso molecular más alto, lo que sugiere que este complejo podría estar formando oligómeros (Figura complementaria 1b). Para investigar esto más a fondo, realizamos SEC junto con dispersión de luz de múltiples ángulos (SEC-MALS) en este complejo en diferentes concentraciones. Este análisis muestra que MuvB puede oligomerizarse de manera dependiente de la concentración (Figura complementaria 1c). Los oligómeros de MuvB se pueden estabilizar incubando brevemente el complejo con glutaraldehído, lo que hace que eluyan como picos parcialmente superpuestos en SEC (Figura complementaria 1a). Se puede aislar un complejo monomérico MuvB a partir de oligómeros mediante SEC (Figura complementaria 1a). Este procedimiento de reticulación fue fundamental para obtener una muestra altamente homogénea que podría usarse para preparar rejillas crio-EM (Figura complementaria 7a). Por lo tanto, obtuvimos un mapa de reconstrucción 3D con una resolución de 3,5 Å (Figuras complementarias 7 a 9). La excelente calidad del mapa crio-EM (Figuras complementarias 8 y 9) permitió la construcción ab initio de un modelo atómico de una estructura de ~70 kDa que representa la RbBP4 que contiene el dominio WD40, el dominio en la vía relacionada con Rb (DIRP ), y el dominio tudor de LIN9, el dominio medio (MD) y un bucle rico en prolina (PRL) de LIN37 (Figs. 1a-c y 2a-d). Llamamos a esta porción de MuvB como subcomplejo RbBP4 (Fig. 2a). Sorprendentemente, el resto del complejo MuvB no es visible en nuestro mapa, lo que indica que estas regiones del complejo son muy móviles con respecto al subcomplejo RbBP4.

a – d Representación de dibujos animados que muestra la estructura del subcomplejo RbBP4. La posición de este complejo en relación con todo el modelo se ilustra en (a, b). Las palas del dominio RbBP4 WD40 están numeradas en (b). RbBP4 se muestra en una representación de superficie en c para resaltar la interacción extendida de los dominios N-terminales de LIN9 (DIRP y tudor) y el bucle rico en prolina (PRL) del dominio medio de LIN37. e, f LIN37CTD une el complejo RbBP4 con el ADN nucleosomal (SHL −7).

A excepción del LIN37 PRL, observamos que nuestros resultados obtenidos utilizando el complejo apo MuvB completo son consistentes con los resultados de un estudio cristalográfico reciente que informa la estructura de un subcomplejo aislado LIN9DIRP-Tudor-RbBP4-LIN37MD9. El RMSD entre nuestra estructura crio-EM y la estructura cristalina publicada es de 0,658 Å.

En nuestra estructura, la región amino-terminal de LIN9, incluido el DIRP y el dominio tudor, interactúa ampliamente con RbBP4 en cuatro sitios diferentes alrededor de la hélice amino-terminal α1 de RbBP4 conservada (Fig. 2b-d), que es un centro de proteína-proteína. interacción en varios otros complejos que contienen RbBP428,29,30. Esta interacción entierra una superficie total de 2809 Å2.

El dominio RbBP4 WD40 consta de una hélice hecha de siete palas y exhibe un lado llamado "superior", que es menos ancho que el inferior (Fig. 2b). En la parte superior, las hojas uno y siete forman un primer parche para LIN9 α1 y 2, que están orientadas aproximadamente 90 grados entre sí (Figs. 1b, 2b-d y Fig. complementaria 9b). Además, LIN9 α2 se empaqueta contra la hélice amino-terminal de RbBP4 (Figs. 1b, 2b-d y Fig. Suplementaria 10c). LIN9 α3, 4 y 5 aumentan las interacciones adicionales con la parte carboxi-terminal de la hélice amino-terminal de RbBP4, donde LIN9 alcanza el lado inferior del dominio WD40 en la hoja 6 (Fig. 2c, d). El bucle básico que sigue a la hélice 5 ocupa el sitio de unión de la histona H4 de RbBP442, al estar intercalado entre RbBP4 α1 y el bucle PP que proviene de la hoja 6 (Fig. 2b, c). Consistentemente, un complejo MuvB reconstituido no es capaz de unirse a los péptidos H49.

El dominio tudor de LIN9 está intercalado entre LIN9 α3 y 6, y el comienzo de RbBP4 α1 (Figs. 1b, 2b-d y Fig. complementaria 9e). La última interacción está mediada por RbBP4 Arg15 y Glu14, que interactúa con los pares Tyr269-Glu270, Arg229-Arg231 provenientes del dominio tudor LIN9 (Figura complementaria 9e). Pares de arginina similares en dominios tudor en tándem están involucrados en la unión al ADN43. Dado que estos residuos de arginina interactúan fuertemente con RbBP4, es poco probable que el dominio tudor LIN9 esté involucrado en la unión al ADN. Además, este dominio no participa en la unión de péptidos de histonas9, lo que sugiere que el dominio tudor LIN9 tiene un papel exclusivamente estructural en el ensamblaje del subcomplejo RbBP4 y no un papel de reclutamiento ni para el ADN ni para las histonas. Consistentemente, en nuestra estructura MMBcore:nucleosoma, el dominio tudor está ubicado lejos de las histonas o del ADN y no hace ningún contacto obvio con ellos (Fig. 1b).

LIN37MD está formado por 1 hélice que lleva una secuencia PLYxCRxW conservada (Figs. 1b, 2a – d y Figs. complementarias 9a – c, 10a). Estos residuos interactúan con LIN9 α1 y 2, y con el bucle de inserción RbBP4, procedente de la hoja 1 (Figura complementaria 9b, c). A esto le sigue un bucle corto y una pequeña hoja β, que se colocan en LIN9 α1 (Figura complementaria 9c). Esta interacción involucra LIN37 Glu111 y LIN9 Arg108 y contactos hidrófobos extendidos (Figura complementaria 9c).

Sorprendentemente, un PRL C-terminal conecta LIN37 a LIN9 α4, fortaleciendo así a LIN9 en RbBP4 (Figura complementaria 9a y Figuras 1a, c, 2c, d). Nuestra estructura sugiere que LIN37 tiene un papel clave en la estabilización del complejo MuvB y, consistentemente, aún se puede formar MuvB reconstituido sin LIN37, pero es menos estable como lo muestra la fotometría de masas (Figuras complementarias 2c, d). Esto es consistente con otros hallazgos que muestran que LIN37 no es necesario para el ensamblaje de MuvB44; sin embargo, nuestro análisis estructural-funcional muestra además que, de hecho, está involucrado en la estabilidad compleja.

Nuestra estructura del subcomplejo RbBP4 encaja fácilmente en el módulo MuvBHEAD del mapa crio-EM MMBcore, donde ocupa la mayor parte de esta densidad crio-EM (Figuras complementarias 5a, c, d y Película complementaria 1). El acoplamiento es inequívoco ya que las estructuras secundarias visibles en el mapa crio-EM coinciden con las coordenadas atómicas (Figura complementaria 5d y Película complementaria 1). La densidad adicional se extiende desde el PRL de LIN37 y podría asignarse sin ambigüedades al LIN37CTD conservado, que se pliega en una hélice α retorcida (Fig. 1b, c, Figs. Suplementarias 5a, d, 10b y Película complementaria 1). Esta asignación es consistente con nuestros datos XL-MS (Fig. 6c complementaria) donde se observan varios enlaces cruzados entre LIN37CTD y LIN9 α5 y 6, lo que respalda el hecho de que estas porciones del complejo están próximas entre sí.

LIN37CTD contiene muchos residuos básicos que se enfrentan al ADN de entrada nucleosomal del núcleo MMB: estructura del nucleosoma (Figs. 1b, c, 2e, f, 3a-c), lo que sugiere que este dominio está involucrado en el anclaje del MuvBHEAD en el lado externo del nucleosoma. ADN de entrada. De acuerdo con esto, un complejo MuvBcore reconstituido sin LIN37CTD (mutante ΔLIN37CTD) se une al nucleosoma con menor afinidad que el MuvBcore de control (Fig. 3f, carriles 5 a 7 versus 1 a 4).

a, b vista en primer plano desde a del canal de proteína en forma de V formado por B-MYBCTH:LIN9CC:LIN52CC y LIN37CTD. Para mayor claridad, no se muestran los bucles LIN37CTD y LIN9CTD. c Este canal, que contiene residuos básicos (indicados) que sujetan el ADN de entrada, se representa aquí como una representación del potencial de superficie electrostático (-/+5.000). d, e Análisis mutacional basado en estructura para validar funcionalmente las interacciones entre LIN37, B-MYB y el nucleosoma en EMSA. Se analizó la capacidad de MuvBcore o MMBcore que contenía LIN37 o no (ΔLIN37), o que contenía un truncamiento NTD de LIN37 (LIN37ΔNTD), para determinar su capacidad para unirse a NCP 167 (en una relación molar de 1:1, 1:2, 1:4 NCP: MuvB). Las cuantificaciones para d se representan en (e). Los datos se presentan como valores medios ± error estándar de la media de tres experimentos independientes (n = 3). f MuvBcore que contiene FL-LIN37, o su truncamiento NTD (LIN37ΔNTD), o su truncamiento CTD (LIN37ΔCTD), se analizaron como en (d). Este experimento se repitió de forma independiente tres veces con resultados similares. g – i Alineación de secuencia que muestra la conservación en el LIN37 NTD. Se indica la región del motivo RRKKRR mutada en los ensayos en hyi. h, i MuvBcore que contiene LIN37 o LIN37 Arg a mutantes puntuales de Glu, es decir, R64E/R68E/R73E/R74E/R77E/R78E (RRKKRR), R19E/R37E (NTD_R) y R19E/R37E/K5A/K7A/K10A/K32A/ K46A/K54A (NTD_RK), se analizaron como en d para determinar la unión al nucleosoma (h) o al ADN (i). Estos experimentos se repitieron de forma independiente tres veces con resultados similares. j EMSA con NCP 167 y MuvBcore o MuvBHEAD-LIN37FL o LIN9CC:LIN52 o LIN9CC-CTD:LIN52, para analizar la capacidad de MuvBHEAD y MuvBTAIL para unirse al nucleosoma. Las relaciones molares utilizadas aquí fueron 1:1, 1:2, 1:4 complejo NCP:MuvB. Este experimento se repitió de forma independiente tres veces con resultados similares.

En conclusión, el subcomplejo RbBP4 se forma en las láminas 1 y 6 de RbBP4, donde se unen LIN9 DIRP y tudor, y este conjunto se estabiliza mediante el dominio medio LIN37 y PRL (Fig. 1a y Fig. complementaria 9a). La unión al nucleosoma estabiliza LIN37CTD con respecto al subcomplejo RbBP4, que se extiende desde LIN37PRL hasta la superficie exterior del ADN de entrada al nucleosoma (Fig. 1b), contribuyendo así a la unión del nucleosoma.

El módulo MuvBTAIL está anclado en el ADN de entrada nucleosomal que se extiende hacia el disco nucleosomal (Fig. 1b, c). Sorprendentemente, MuvBHEAD y MuvBTAIL forman un túnel en forma de V que se sujeta al ADN de entrada (Figs. 1b, c, 3b, cy Película complementaria 1).

La mayor parte de MuvBTAIL está compuesta por el extremo C de LIN9 que incluye un dominio en espiral que interactúa con el dominio en espiral LIN52 (en adelante denominado LIN9: 52CC) y con la hélice C-terminal (CTH) B-MYB. La estructura de este subcomplejo de MMB se resolvió previamente mediante cristalografía de rayos X45 y podría encajar sin ambigüedades en nuestro MuvBTAIL: reconstrucción crio-EM de nucleosoma (Figuras complementarias 5a, b, f y Película complementaria 1).

LIN9:52CC se une al ADN de entrada en la ubicación superhelicoidal (SHL) −8, ubicada en los últimos 10 pares de bases en un extremo de la construcción de 167 ADN nucleosomal utilizada. Esta interacción está mediada principalmente por B-MYBCTH, que contiene dos residuos de arginina orientados hacia el ADN (es decir, Arg672 y Arg682) (Figs. 1b, cy 3b, c). De acuerdo con esto, MMBcore se une al nucleosoma mejor que MuvBcore (Fig. 3d, compare los carriles 1 a 4 con los carriles 8 a 10 y la Fig. 3e).

El LIN37NTD básico presenta varios enlaces cruzados con MuvBTAIL principalmente en el módulo LIN9:52CC (Figuras complementarias 6c y 3g), lo que sugiere que esta región está cerca del ADN nucleosomal. Por lo tanto, investigamos si LIN37NTD podría contribuir a la unión de nucleosomas. Sorprendentemente, la eliminación de esta porción de LIN37 suprime la unión de MuvBcore a los nucleosomas (Fig. 3d, carriles 1 a 7 y Figs. 3e y 3f, carriles 1 a 4 frente a carriles 8 a 10). Es importante destacar que la eliminación de LIN37NTD no alteró la estabilidad estructural ni el ensamblaje de MuvBcore (Figura complementaria 2h). Dado el sorprendente efecto de esta mutación, reducimos la porción de LIN37NTD que contribuye a la unión del nucleosoma y descubrimos que MuvBcore necesita absolutamente una secuencia que contenga un motivo RRKKRR (residuos 64-78) para unirse tanto al nucleosoma como al ADN libre (Fig. .3g–i, carriles 1–7). Sorprendentemente, el mismo motivo tiene una función de unión al ADN en INCENP46.

En resumen, el complejo MMBcore sujeta el ADN de entrada nucleosomal a través de un túnel proteico formado por MuvBHEAD y MuvBTAIL (Fig. 1b, cy 3b, c), y la unión del ADN depende principalmente de LIN37 y B-MYB.

Es importante destacar que tanto MuvBHEAD como MuvBTAIL son necesarios para una actividad de unión completa a los nucleosomas. De hecho, la construcción MuvBHEAD-LIN37NTD, así como las construcciones que contienen un subcomplejo LIN9CC:LIN52 o LIN9CC-CTD:LIN52, no pueden unirse al nucleosoma individualmente (Fig. 3j, carriles 1 a 4 versus carriles 5 a 13). ).

En nuestra estructura MMBcore:nucleosoma, el nucleosoma está remodelado. La comparación entre este nucleosoma y una reconstrucción de apo nucleosoma, aislada de nuestro conjunto de datos crio-EM mediante clasificación 3D (Fig. 4a – c y Fig. complementaria 4c), muestra que 20 pares de bases del ADN de entrada (de SHL −6 a SHL − 8) se giran 50 grados sobre el disco nucleosomal y se mantienen en posición mediante el complejo MMBcore (Fig. 4a-d). Este ADN de entrada se eleva unos 25 Å hacia arriba en su extremo, como es visible en nuestra densidad. Además, el ADN de entrada está doblado hacia adentro con respecto a un nucleosoma normal (Fig. 4e). Sorprendentemente, la densidad que se extiende desde el extremo N de LIN9CC pasa por debajo del ADN de entrada que lo bloquea (Fig. 5f complementaria y Fig. 1b, c), antes de continuar hacia el extremo N de LIN9 en el módulo MuvBHEAD. Esto sugiere que el complejo MMB atrapa topológicamente el ADN de salida nucleosomal.

La vista de díada de la estructura MMBcore:NCP se muestra en (b), codificada por colores como se especifica en (a). El LIN9CTD no muestra mejor visualización del ADN nucleosomal distorsionado. c La densidad crio-EM se muestra para el complejo NCP dentro de MMBcore: NCP (Figura complementaria 5g) o apo NCP (Figura complementaria 4c). Esta comparación muestra el cambio conformacional en −/+7 ubicaciones SHL. d – f Las distorsiones del ADN se visualizan en detalle con diferentes vistas del modelo NCP (ADN en representación de superficie) de la estructura MMBcore:NCP que se superpone a un modelo apo NCP (ADN en representación de cinta). g Perfil de digestión MNasa de NCP167 en ausencia y presencia de MMBcore. Este experimento se repitió de forma independiente tres veces con resultados similares. h Ilustración de dibujos animados del complejo nucleosoma:H1 (PDB-ID: 5Nl0) i El experimento EMSA muestra que la titulación de H1 reduce la asociación de NCP con el núcleo MMB. Este experimento se repitió de forma independiente tres veces con resultados similares.

Por otro lado, ~ 10 pares de bases del ADN de salida en SHL +7 no son visibles en nuestro complejo (Fig. 4f), lo que indica que este tramo de ADN está desordenado. Curiosamente, el desenvolvimiento en SHL +7 también se observa en estructuras de complejos de remodelación de cromatina dependientes de ATP con el nucleosoma47,48.

De 167 pb, solo 147 pb son visibles en nuestro MMBcore: estructura de nucleosoma. De manera consistente con esto, el ensayo de digestión con MNasa del nucleosoma en presencia de MMBcore muestra la estabilización de un fragmento de 147 pb (Fig. 4g).

La comparación estructural del complejo MMBcore:nucleosoma, con el complejo histona H1:nucleosoma49 muestra que la unión simultánea de MMB y H1 en el mismo nucleosoma sería incompatible (Fig. 5e y h). Esto se debe, en primer lugar, a que, de manera similar a la histona enlazadora H1, MuvBHEAD se localiza cerca de la díada del nucleosoma (Fig. 4b, h); en segundo lugar, la ruta del ADN de salida está muy reorganizada en el complejo MMBcore:nucleosoma y no es compatible con la formación de un complejo H1:nucleosoma (Fig. 4d, e y h). De acuerdo con esto, agregar H1 a un complejo MMBcore:nucleosoma reduce la cantidad de MMBcore:nucleosoma, mientras que se forma el complejo H1:nucleosoma (Fig. 4i).

La última hélice de LIN9 (α12) interactúa con el parche ácido del nucleosoma y la histona H4. En (b) se muestra una vista ampliada de a. Aunque la resolución de nuestros datos estructurales en esta área no permite resolver las cadenas laterales, posibles interacciones de cadenas laterales entre la secuencia NRD C-terminal de LIN9 y los residuos de las histonas H2A y H2B (los residuos ácidos son parte del parche ácido del nucleosoma) y H4 se modelan basándose en el acoplamiento de elementos de estructura secundaria en el mapa NCP:LIN9CTD (Figura complementaria 5f, h) y se representan aquí. c El péptido LANA compite con MuvB por unirse al nucleosoma. Se ejecutó un complejo de MuvB con un nucleosoma que contenía una secuencia de CHR en un EMSA en ausencia o presencia de concentraciones crecientes de péptido LANA. Este experimento se repitió de forma independiente tres veces con resultados similares. d Modelado de un complejo MMB-FOXM1:nucleosoma. El modelo AlphaFold de la figura complementaria 6d se superpuso al LIN9CTD. La interacción con el elemento CHR se modeló superponiendo el ADN de PDB-ID: 5FD3 en la región SHL −8 de nuestro complejo MMBcore:nucleosoma. FOXM1 se modeló superponiendo el ADN de PDB-ID: 7FJ2 en la región SHL −7 de nuestro complejo MMBcore:nucleosoma. El posicionamiento de FOXM1 en el ADN de entrada lo sugieren las preferencias de unión nucleosomal de los FOX TF relacionados con FOXM167. e Caricatura esquemática del complejo en (d). Los bucles de proteínas en a y d están ocultos para reducir la complejidad de la ilustración. e, f Se ilustra un modelo de función del factor de transcripción pionero del complejo MMB. Los sitios CHR están ubicados justo aguas arriba de un nucleosoma y están expuestos como partes de regiones empobrecidas de nucleosoma (NDR)7,68. Durante la fase S, cuando se forma MMB, la remodelación de un nucleosoma mediante la función del factor de transcripción pionero de MMB permitiría la exposición de secuencias que actúan en cis, incluido el TSS. Esto permitiría el establecimiento de competencia para la activación transcripcional en genes del ciclo celular. Esto, combinado con el reclutamiento de factores posteriores y remodeladores de cromatina dependientes de ATP, podría promover la formación del complejo de preiniciación (PIC) y el reclutamiento de la ARN polimerasa. MMB también puede participar en las interacciones promotor-potenciador56,57. La activación completa de los genes G2/M es un proceso muy complejo que requiere modificaciones postraduccionales tanto en B-MYB como en FOXM120,27.

En conclusión, el complejo MMBcore se une al ADN de entrada, distorsionándolo, lo que lleva a la exposición de aproximadamente 10 pares de bases de ADN nucleosomal en y debajo de las ubicaciones +/-7 SHL. Nuestra hipótesis es que este ADN expuesto puede ser accesible para los TF posteriores y también puede facilitar el ensamblaje de la maquinaria transcripcional, como se analiza más adelante.

Se ha demostrado que RbBP4, cuando se une a LIN9 y LIN37, es capaz de unirse a la cola de histona H39. En nuestra estructura, RbBP4 está cerca de la cola de la histona H3 (Fig. 1c), lo que indica que el modo de unión de MMB con el nucleosoma permitiría interacciones entre RbBP4 y la cola H3. Sin embargo, nuestros datos crio-EM no resuelven dicha interacción directamente. En general, las colas de histonas no son necesarias para la formación del complejo MuvBcore:nucleosoma (Figura complementaria 3d). Además, no podemos ver ningún efecto al agregar la modificación H3K4me3, que está presente en los promotores objetivo de MuvB, en la formación del complejo MuvBcore:nucleosoma (Figura complementaria 3e).

Por otro lado, nuestros mapas crio-EM muestran la densidad para el LIN9CTD conservado que emerge del extremo C-terminal del dominio LIN9CC (Figuras complementarias 5f, h, 10d, Figura 1b, cy Película complementaria 1). Este dominio está compuesto por un haz de 4 hélices donde la hélice C-terminal más larga (α12) se extiende sobre el disco del nucleosoma hasta que su extremo C se acopla al parche ácido del nucleosoma y a la histona H4 vecina (Fig. 5a, b). Consistentemente, concentraciones crecientes del péptido LANA50 aglutinante de parche ácido pueden competir con MuvB por la unión de nucleosomas, incluso en presencia del elemento CHR (Fig. 5c).

Además, nuestros datos de entrecruzamiento sugieren que LIN9CTD interactúa con LIN54CTD (Fig. 1a y Fig. complementaria 6d). Utilizamos AlphaFold51 para modelar esta interacción (Fig. 6d – f complementaria) y así obtener un modelo completo del complejo MMB:nucleosoma completo (Fig. 5d). Este ejercicio de modelado sugiere que LIN54CTD puede ocupar una cavidad entre LIN9CTD, LIN9:52CC y el ADN. Esta disposición colocaría los dominios de unión al ADN de LIN54 cerca de un elemento CHR en el SHL −8 del nucleosoma (Figs. 1a y 5d). LIN54sh se reticula con todas las demás subunidades MuvB (Figura complementaria 6e), lo que respalda nuestro modelado de que LIN54 está presente en el centro de MuvB entre los módulos TAIL y HEAD.

En conclusión, nuestros datos sugieren que LIN9CTD es un componente crítico del complejo MMB, que conecta MuvB directamente con el parche ácido del nucleosoma y con el CHR mediante el reclutamiento de LIN54.

Nuestra estructura crio-EM muestra que el complejo MMB consta de dos módulos principales, aquí denominados MuvBHEAD y MuvBTAIL. Estos dos módulos están unidos de manera flexible por la proteína de andamio principal del complejo LIN9 (Fig. 1b, cy Película complementaria 1). LIN9 orquesta el ensamblaje de MuvBHEAD a través de su dominio N-terminal DIRP y tudor y el ensamblaje de MuvBTAIL a través de su dominio C-terminal en espiral, que recluta LIN52CC y B-MYBCTH. LIN9 junto con RbBP4 recluta LIN37 a través de su dominio medio en MuvBHEAD. LIN37 es un factor estabilizador ya que refuerza LIN9 en RbBP4 y, además, mostramos que LIN37 dentro del complejo MuvB es una proteína de unión al ADN. Los extremos LIN37 son esenciales para la capacidad total de unión a nucleosomas del complejo MuvB. Sorprendentemente, estas regiones se vuelven menos importantes para la unión de nucleosomas en presencia de B-MYB. De hecho, el complejo MMBcore aún puede unirse a un nucleosoma en ausencia de LIN37 (Fig. 3d). Nuestra estructura muestra una explicación para esto. B-MYBCTH reclutado por LIN9:52CC contacta directamente con el ADN de entrada aguas arriba de LIN37 (Figs. 1b, 3b, cy Película complementaria 1). Esto es consistente con datos anteriores que muestran que el extremo C de B-MYB es suficiente para la activación transcripcional dependiente de B-MYB52,53 y que LIN37 es prescindible para las funciones de activación transcripcional de MuvB44,54.

Nuestro complejo MMB:nucleosoma también muestra que MMB se une al nucleosoma con una estequiometría 1:1 e inicia la remodelación de la cromatina, que es una característica funcional de los TF pioneros. Al sujetar el ADN de entrada, MMB levanta 20 pares de bases, exponiendo así el ADN en SHL −7. El ADN que sigue a la distorsión no es visible en otras estructuras pioneras de complejos TF34,35. En nuestra estructura, esta región es visible porque está sujeta por el propio complejo MMB.

¿Cómo se logra esta remodelación? Tal cambio conformacional requiere la interrupción de las interacciones entre la histona H3 con SHL −7 (Fig. 4d). De manera similar a otros TF pioneros, en el caso de MMB, la interrupción de las interacciones entre histonas y ADN puede compensarse mediante la energía de unión entre MMB y el ADN nucleosomal. Además, RbBP4 tiene una carga muy negativa y está ubicado cerca de SHL −6 (Fig. 4b), donde comienza la distorsión del ADN. En base a esto, surge una hipótesis intrigante según la cual un mecanismo de repulsión de carga entre RbBP4 y el ADN en SHL −7 podría contribuir a la desviación de la ruta del ADN. Esto también podría explicar la alta movilidad de MuvBHEAD con respecto al nucleosoma como se observa en nuestros datos crio-EM (Figura complementaria 4f). Además, observamos una densidad proveniente del extremo N de LIN9CC dirigida hacia MuvBHEAD (Fig. 1c y Fig. Suplementaria 5f). Esto sugiere que MMB atrapa topológicamente el ADN de entrada, contribuyendo así a mantener el ADN en su posición.

La conformación del ADN de entrada/salida en nuestra estructura del complejo MMB:nucleosoma no sería compatible con la unión del conector histona H1. Consistentemente, demostramos que H1 puede competir con MMB desde el nucleosoma (Fig. 4e y 4h, i). Esto es consistente con el hecho de que las regiones que contienen CHR tienen características típicas de genes que transcriben activamente12 y no de regiones de heterocromatina, que están enriquecidas en H155.

Es importante destacar que LIN54 y la secuencia CHR objetivo de MuvB no están incluidas en nuestra estructura MMB:nucleosoma, lo que indica que la remodelación dependiente de nucleosoma por parte del complejo MMB es independiente del reconocimiento de CHR y, por lo tanto, la remodelación sería una propiedad intrínseca del complejo central MMB. Además, observamos que la última hélice de LIN9 se inserta en el parche ácido del nucleosoma (Fig. 5a, b). Esto sugiere que una interacción directa del complejo MMB con el nucleosoma contribuye al anclaje y posicionamiento del complejo en el nucleosoma. La capacidad de unirse tanto al ADN nucleosomal como al octámero de histonas podría explicar por qué MuvB estabiliza los nucleosomas9.

Teniendo en cuenta el trabajo anterior y el actual, proponemos un modelo de función de MMB como un complejo TF pionero (Fig. 5d-f). MuvB desmontado de DREAM en la transición de fase G1 / S se ensambla con B-MYB, formando así el complejo MMB (Fig. 5d, e). El complejo MMB está ubicado en los elementos del ADN CHR, cerca del TSS y el nucleosoma +1. Este nucleosoma es remodelado por MMB, exponiendo así el ADN en -/+7 ubicaciones SHL (Fig. 5d, e).

Esto facilitaría el reclutamiento de factores de transcripción posteriores (es decir, FOXM1)20 y el ensamblaje de la maquinaria transcripcional basal en el TSS. Se ha demostrado que MMB participa en las interacciones entre el promotor basal y los elementos potenciadores56,57, lo que respalda la importancia de este complejo en la activación transcripcional de genes mitóticos.

En conclusión, nuestra investigación estructura-función del complejo MuvB brinda información sobre el ensamblaje complejo, las interacciones y el modo de unión con un nucleosoma. Nuestro estudio allana el camino para la investigación de un modelo mecanicista de la función MuvB en la activación transcripcional y la oncogénesis mediada por B-MYB.

Las secuencias codificantes optimizadas con codones (CDS) de tipo salvaje, truncamientos y mutantes puntuales de las proteínas MuvB y B-MYB humanas se obtuvieron de Genscript o GeneArt (Thermo Fischer Scientific) y se clonaron en el vector pFASTBAC-1 o pACEBAC-1. utilizando métodos estándar. Los límites de construcción son los siguientes: LIN9FL(1–542), LIN9MuvB(HEAD)(94–278), LIN9CC(325–450), LIN9CC-CTD(332–542), LIN37FL(1–246), LIN37ΔNTD(92– 246), LIN37ΔCTD(1–132), RbBP4FL(1–425), LIN52FL(1–116), LIN54CTD(635–749), LIN54short(515–749), B-MYBFL(1–700).

Mutantes puntuales en LIN37FL: LIN37RRKKRR(R64E/R68E/R73E/R74E/R77E/R78E), LIN37NTD_R(R19E/R37E), LIN37NTD_RK(R19E/R37E/K5A/K7A/K10A/K32A/K46A/K54A). Para la expresión y el ensamblaje del complejo MuvB, se coinfectaron células Hi-5 con una densidad de 1,5 x 106 células ml-1 con precultivos de células Sf9, cada una preinfectada con baculovirus MuvB recombinantes. Las células se recolectaron con una viabilidad de ~85%, lo que normalmente tomó aprox. 48 h y almacenado a −80 °C hasta su procesamiento. La proteína B-MYB se expresó por separado de manera similar a MuvB.

Se resuspendieron células Hi-5 que expresaban (sub)complejos MuvB (naturales o mutantes) en tampón que contenía Tris pH8 50 mM, NaCl 300 mM, TCEP 0,5 mM, glicerol al 5 %, EDTA 1 mM, PMSF 0,1 mM, 2 mM. benzamidina, 5 U ml-1 de benzonasa (Novagen), inhibidores completos de proteasa sin EDTA (Roche) y se lisan mediante sonicación seguida de centrifugación. La fracción soluble filtrada del lisado se cargó en una columna Strep-Tactin Superflow (30060, Qiagen) para su purificación utilizando la etiqueta StrepIIx2 en LIN37 o RbBP4 (este último en el complejo MuvB ΔLIN37). La proteína unida se lavó con 20 VC con tampón que contenía Tris 50 mM, pH 8, NaCl 300 mM, TCEP 0,5 mM, glicerol al 5 %, seguido de un lavado con 4 VC, Tris 50 mM, pH 8, NaCl 1000 mM, TCEP 0,5 mM, glicerol al 5 %. y posteriormente se eluyó con tampón que contenía Tris 50 mM pH 8, NaCl 300 mM, TCEP 0,5 mM, glicerol al 5 %, d-destiobiotina 2,5 mM. La etiqueta de estreptococo se eliminó mediante una incubación a 4 °C durante la noche con proteasa 3 C. El pulido final se logró mediante SEC en una columna S200 o Superose 6 (GE Healthcare) en un tampón que contenía HEPES 20 mM, pH 8, NaCl 150 mM, TCEP 0,5 mM. Se reunieron las fracciones máximas y se concentraron hasta 5 mg/ml.

La proteína B-MYB se purificó por separado según el protocolo anterior. Para el ensamblaje del complejo MMB, se mezclaron proteínas MuvB:B-MYB recién preparadas en una proporción de 1:4 y se incubaron en hielo durante 1 h seguido de SEC en una columna Superose 6 en tampón que contenía HEPES 20 mM, pH 8, NaCl 100 mM, TCEP de 0,2 mM.

Se expresó H1 recombinante con etiqueta de hexahistidina N-terminal y etiqueta StrepIIx2 C-terminal en Escherichia coli. La expresión de proteínas se indujo añadiendo IPTG 0,5 mM cuando la DO600 alcanzó 0,7 y se dejó continuar durante la noche a 18 °C. Las células se lisaron mediante sonicación. La proteína H1 se purificó utilizando Strep-Tactin Superflow Plus (QIAGEN) y HiTrap Heparin HP (GE Healthcare) según el protocolo estándar. Tanto las etiquetas N-terminal como C-terminal se eliminaron mediante digestión con proteasa 3C durante la noche. La proteína H1 sin etiquetar se pasó a una columna S200 16/600 (GE Healthcare). Las fracciones H1 puras se concentraron, se congelaron instantáneamente en nitrógeno líquido y se almacenaron a -80 °C para su uso posterior.

Las histonas humanas recombinantes H2A, H3, H4 y Xenopus laevis H2B se sobreexpresaron por separado en Escherichia coli, se purificaron a partir de cuerpos de inclusión y se ensamblaron juntas en un octámero de histonas como se describió anteriormente58. Brevemente, los cuerpos de inclusión para cada histona se resolubilizaron individualmente en un tampón que contenía urea y se purificaron adicionalmente mediante una columna de intercambio iónico. Las histonas desnaturalizadas se mezclaron en una relación molar H2A:H2B:H3:H4 de 1,2:1,2:1:1 y se dializaron frente a un tampón de replegamiento que contenía NaCl 2 M, Tris-HCl 10 mM, pH 7,5, EDTA 1 mM y β 10 mM. -mercaptoetanol. El octámero de histona replegado se purificó a partir de agregados y el exceso de dímero H2A-H2B usando filtración en gel en una columna S200 16/600 (GE Healthcare), ejecutada en el mismo tampón de replegamiento. Las fracciones de octámero de histonas puras se concentraron, se mezclaron hasta una concentración final de glicerol del 50 % (v/v) y se almacenaron a -20 °C para su uso posterior.

El ADN nucleosomal se preparó utilizando el kit Plasmid Giga (QIAGEN). Plásmido que contiene cuatro repeticiones de una secuencia de 167 pb (TAC CCG GGA TAT CGA GAA TCC CGG TGC CGA GGC CGC TCA ATT GGT CGT AGA CAG CTC TAG CAC CGC TTA AAC GCA CGT ACG CGC TGT CCC CCG CGT TTT AAC CGC CAA GGG GAT TAC TCC CTA GTC TCC AGG CAC GTG TCA GAT ATA TAC ATC CGA TAT CCC GGG TA) se transformó en bacterias XL10 Gold. Las células se cultivaron durante la noche y la extracción del plásmido se realizó según el protocolo del QIAGEN Plasmid Giga Kit. El plásmido extraído se digirió con BstZ17I (NEB) durante la noche. El ADN nucleosomal de 167 pb se purificó a partir del ADN vector mediante una columna de intercambio iónico. Se inactivó una pequeña cantidad de BstZ17I mediante extracción con fenol-cloroformo.

El ADN nucleosomal que contiene la secuencia CHR se preparó mediante reacción en cadena de la polimerasa (PCR). La PCR se realizó según el protocolo estándar utilizando Taq ADN polimerasa con tampón ThermoPol® (NEB). Se utilizó la secuencia Widom 601 como plantilla y la reacción de PCR se amplió hasta un volumen de reacción de 20 ml. El producto de la PCR se purificó utilizando una columna de intercambio aniónico HiTrap Q HP (GE Healthcare). Las fracciones que contenían ADN nucleosomal puro se combinaron, se precipitaron con etanol, se disolvieron en agua y finalmente se almacenaron a -20 °C para su uso posterior. La secuencia de ADN nucleosomal que contiene la secuencia CHR es GAG TTC AAA ATC GAG AAT CCC GGT GCC GAG GCC GCT CAA TTG GTC GTA GAC AGC TCT AGC ACC GCT TAA ACG CAC GTA CGC GCT GTC CCC CGC GTT TTA ACC GCC AAG GGG ATT ACT CCC TAG TCT CCA GGC ACG TGT CAG ATA TAT ACA TCC GAT.

La reconstitución del nucleosoma (NCP167 y NCP que contiene la secuencia CHR) se realizó como se describió anteriormente58 con modificaciones menores. Brevemente, el octámero de histona y el ADN nucleosomal se mezclaron en una proporción de 1,1:1 en un tampón de reconstitución con alto contenido de sal que contenía NaCl 2 M, HEPES 20 mM, pH 7,5, DTT 5 mM, EDTA 1 mM. La muestra se transfirió a un botón de diálisis (Hampton Research) y el botón se colocó dentro de un vaso de precipitados que contenía el mismo tampón de reconstitución con alto contenido de sal. Se bombeó lentamente al vaso de diálisis un tampón de reconstitución bajo en sal que contenía NaCl 20 mM, HEPES 20 mM, pH 7,5, DTT 5 mM y EDTA 1 mM para reducir gradualmente la concentración de sal y permitir la formación de NCP. La muestra se transfirió a un tampón de reconstitución nuevo bajo en sal después de 24 h y se dejó equilibrar aún más durante 4 h. El NCP167 soluble se separó de los agregados mediante centrifugación y se almacenó a 4 ° C para su uso posterior.

El NCP167 con la modificación H3K4me3 se compró en ActiveMotif.

El NCP167 reconstituido se diluyó en tampón de digestión que contenía HEPES 20 mM, pH 7,5, NaCl 75 mM, TCEP 1 mM hasta una concentración final de 1,8 μM. La TPCK-tripsina inmovilizada en perlas magnéticas (Takara) se lavó y se equilibró en el mismo tampón de digestión y se mezcló con NCP167 en una proporción de volumen de 1:1. La digestión se detuvo después de 20, 40, 60 y 80 minutos retirando de la solución la tripsina acoplada a perlas magnéticas. Todas las muestras se analizaron en SDS-PAGE para evaluar la finalización de la eliminación de las colas de histonas.

El NCP se mezcló con MMBcore a una concentración de 0,6 y 1,8 μM, respectivamente y se completó con tampón EMSA que contenía HEPES 20 mM, pH 7,5, NaCl 50 mM, TCEP 0,5 mM hasta un volumen final de 10 μL. Como control, también se preparó por separado una reacción que contenía NCP sola. Se añadió tampón de reacción MNasa (NEB) a cada muestra a una concentración final de 1x. Luego se agregaron 2,5 μl de 1000 unidades/μl de MNasa (NEB) a cada muestra. La reacción se llevó a cabo a temperatura ambiente. Se tomaron alícuotas de 3 μL de cada muestra a los 30 s, 1 min y 1,5 min después de la adición de MNasa. La reacción se terminó añadiendo solución de Proteinasa K (ThermoFisher Scientific) a cada alícuota. Las muestras se analizaron en gel TBE NovexTM al 4-12 % (ThermoFisher). Los geles se tiñeron con SYBR Safe y se escanearon con un generador de imágenes Typhoon FLA 9500.

La SEC analítica acoplada con dispersión de luz láser de múltiples ángulos (MALS) se realizó en un sistema HPLC Agilent 1260 Infinity II. Los perfiles de dispersión de luz y índice de refracción diferencial (dRI) de las muestras se analizaron en línea utilizando los instrumentos DAWN y Optilab de Wyatt Technologies. Se aplicaron muestras de complejo MuvB purificado a diferentes concentraciones (volumen de 20 µL) a una columna Superose 6 3,2/300 (GE Healthcare) equilibrada con HEPES 20 mM, pH 7,5, NaCl 150 mM, TCEP 0,5 mM a un caudal de 0,05 ml/ mín. Los datos se analizaron según el modelo de dispersión de luz de Zimm y un dn/dc de 0,185 ml/g en el software ASTRA 7.3.1 (Wyatt).

Los experimentos de fotometría de masas se realizaron en un fotómetro de masas Refeyn OneMP (Refeyn Ltd, Oxford, Reino Unido) como se describió anteriormente59. Se limpiaron cubreobjetos de microscopio (630-2187, VWR) y juntas de silicona CultureWell™ (GBL103250, Sigma-Aldrich) con isopropanol al 100 % y agua y se secaron con aire comprimido. Las juntas se colocaron encima de los cubreobjetos limpios en la etapa de muestra del fotómetro de masas según las instrucciones del fabricante.

Todas las mediciones se realizaron al menos cinco veces de forma independiente, en pocillos separados, en tampón que contenía HEPES 20 mM, pH 8, NaCl 150 mM, TCEP 0,5 mM. En primer lugar, se pipetearon 12 μl de tampón en un pocillo de junta seguido de la adquisición del punto focal utilizando la funcionalidad de enfoque automático en el software Refeyn AcquireMP 2.3.1. En segundo lugar, se pipetearon 2 μL de 500 nM de complejos MuvB (diluidos a esta concentración justo antes de la medición para evitar un desmontaje complejo) en el pozo de junta que contenía el tampón y se mezclaron para observar eventos de aterrizaje individuales por debajo de los niveles de saturación. Se grabaron películas de fotometría masiva de 6000 cuadros desde un campo de visión de instrumento de 10,8 × 10,8 μm. Los datos se procesaron utilizando la canalización predeterminada en el software Refeyn DiscoverMP 2.3.0. Los contrastes de partículas individuales de cada vídeo se convirtieron en masa utilizando una calibración de contraste a masa (C2M) que se realizó en el búfer de adquisición. Los datos se representaron como histogramas normalizados con un ancho de contenedor de 4,4 y se ajustaron a un pico gaussiano. Para la calibración, se agregaron 2 μL de un estándar de proteína sin teñir NativeMark prediluido 1:100 (LC0725, Thermo Scientific) a un pocillo de junta de adquisición; las masas de 66, 146, 480, 1048 kDa se usaron para una curva de calibración estándar en el software DiscoverMP.

Se incubaron 30 µl de complejo MuvB recién purificado a una concentración de 28 µM con 0,1 µl de glutaraldehído al 25 % (G5882, Sigma-Aldrich) durante 2 minutos en hielo, seguido de inactivación con 2 µl de Tris 500 mM pH 8 y SEC inmediata en un Superose 6. Columna 3,2/300 (GE Healthcare) en tampón que contiene Tris 20 mM, pH 8, NaCl 100 mM, TCEP 0,2 mM. Las fracciones eluidas se analizaron mediante SDS-PAGE y las fracciones que contenían monómero MuvB se combinaron y concentraron a 20 μl y se reinyectaron en la columna SEC como se describió anteriormente para eliminar cualquier contaminante de orden superior. La fracción que contenía monómeros se usó inmediatamente para la preparación de la rejilla crio-EM.

NCP167 y MMBcore se mezclaron en una proporción molar de 1:2,5 y se incubaron a 4 oC durante al menos 30 min. GraFix se realizó como se describió anteriormente41. Se generó un gradiente continuo que contenía HEPES 20 mM, pH 7,5, NaCl 50 mM, TCEP 0,1 mM, sacarosa entre 10 y 30 %, glutaraldehído entre 0 y 0,1 % utilizando un Gradient Master (Biocomp). Las muestras se centrifugaron utilizando un rotor de ultracentrífuga SW60 Ti a 165, 100 x g durante 16 h a 4 ° C. Las muestras se fraccionaron manualmente y la reticulación se terminó añadiendo Tris-HCl, pH 7,5, hasta una concentración final de 35 mM. Las fracciones de GraFix se analizaron en una PAGE nativa al 5 %, y las que contenían el complejo NCP167-MMBcore reticulado se concentraron y el tampón se intercambió por Tris-HCl 10 mM, pH 7,5, NaCl 50 mM, TCEP 0,1 mM.

Se aplicaron 2 μl del complejo monomérico MuvB reticulado a rejillas Quantifoil R1.2/1.3 Cu 300 que se descargaron luminiscentemente utilizando Easiglow (Pelco) a 15 mA durante 1 min. Después de la aplicación de la muestra, las rejillas se secaron inmediatamente durante 5 segundos a 4 °C y 100% de humedad y se sumergieron en etano líquido usando un Vitrobot marca IV (Thermo Fisher).

Se aplicaron 2 μL de la muestra tratada con GraFix a rejillas Quantifoil R1.2/1.3 Cu 300 que se descargaron mediante descarga luminosa usando Easiglow (Pelco) a 15 mA durante 1 min. Las rejillas se incubaron durante 5 segundos y luego se secaron (fuerza de transferencia 3) durante 5 segundos a 4 ° C y 100% de humedad y se sumergieron en etano líquido usando un Vitrobot marca IV (Thermo Fisher).

Recopilamos 10.183 pilas de películas en formato EER en un Cryo-TEM Glacios (Thermo Fisher) de 200 kV equipado con un detector Falcon 4, basado en ICR, con un aumento nominal de 240.000, lo que arrojó un tamaño de píxel de 0,567 Å por píxel. Estas películas se procesaron en vivo durante la recolección utilizando el programa en vivo crioSPARC60.

Las pilas de películas se alinearon por fotogramas y se agruparon 4 veces, dando un tamaño de píxel de 2,268 Å por píxel. Se seleccionaron 8820 imágenes con una resolución superior a 6 Å y un movimiento total de 30 píxeles (estimado durante la alineación del cuadro) para su posterior procesamiento. Se utilizó un selector de blobs para la recolección inicial de partículas durante el procesamiento en vivo y para obtener promedios iniciales de clase 2D. Las plantillas generadas a partir de este último se utilizaron para la selección de plantillas y el entrenamiento de TOPAZ61 y la selección con crioSPARC. En total se recogieron 1.184.371 partículas; Las partículas duplicadas se eliminaron utilizando la función "eliminar duplicados" implementada en cryoSPARC. Este paso eliminó partículas doblemente seleccionadas dentro de 60 Å (la dimensión más corta de las partículas MuvB es ~ 50 Å). Estas partículas se limpiaron aún más con otro paso de clasificación 2D (Figura complementaria 7). Estas partículas se canalizaron en la función "modelo ab initio" implementada en cryoSPARC. Se utilizaron tres clases para permitir la clasificación de partículas en el proceso. Esto generó una clase que contenía 250.174 partículas con estructuras de dominio claras y con hélices resueltas. La clasificación 2D de esta clase mostró una mejora en la relación señal-ruido de los promedios de la clase. Luego, estas partículas se importaron en RELION-3.1.162 utilizando pyem y el script csparc2star.py de Daniel Asarnow: Daniel Asarnow, Eugene Palovcak y Yifan Cheng (2019). asarnow/pyem: UCSF pyem v0.5 (v0.5). Zenodo. https://doi.org/10.5281/zenodo.3576630. El refinamiento y la mejora adicional del mapa se realizaron como se describe en 63 y en la Fig. 7 complementaria. Esto produjo un mapa con una resolución de 3,5 Å.

Recolectamos 22,293 pilas de películas en formato MRC en un crio-TEM Titan KRIOS de 300 kV en eBIC (fuente de luz de diamante, sesiones BI21809-34 y BI21809-35), equipado con un detector K3 operado en modo bin de superresolución 2x, a una aumento nominal de 165 kx, lo que produjo un tamaño de píxel de 0,513 Å por píxel. El procesamiento de estos datos se realizó de manera similar al complejo MuvB-apo con las variaciones que se explican a continuación y en las figuras complementarias 4 y 5.

Los promedios de clase 2D muestran una clara densidad adicional que sobresale del nucleosoma (Figura complementaria 4E). La reconstrucción ab initio seguida de la clasificación 3D permitió la eliminación de nucleosomas parcialmente desensamblados y partículas de apo nucleosomas de un núcleo MMB: reconstrucción del complejo de nucleosoma (Figura complementaria 4C). Una clasificación 3D adicional de esta clase muestra una alta movilidad de una porción de MMBcore con respecto al nucleosoma (Figura complementaria F). A esta parte altamente móvil del complejo la llamamos MuvBHEAD. De cuatro clases 3D, una presentó una densidad más clara tanto en MuvBHEAD como en otra parte del complejo MMBcore, aquí llamado MuvBTAIL, que está incrustado en el disco del nucleosoma (Fig. 1B y Fig. Suplementaria 4F). Los refinamientos 3D centrados en MuvBHEAD y MuvBTAIL nos permitieron obtener reconstrucciones con resoluciones de 7,5 y 8,7 Å respectivamente (Fig. complementaria 5A – D, J). Para estudios estructurales sobre las interacciones MuvB:nucleosoma, recopilamos 29.102 pilas de películas adicionales. Los datos de partículas provenientes de la clase MMBcore:nucleosoma obtenidos después de la clasificación 2D y 3D dentro de este segundo conjunto de datos se fusionaron con el primer conjunto de datos en la etapa indicada en la figura complementaria 4C. La clasificación 3D adicional arrojó 237,061 partículas de MMBcore: complejo de nucleosoma (Figuras complementarias 5 y J). Se utilizaron más refinamientos 3D enfocados para obtener mapas MMBcore:DNA, NCP147, NCP:LIN9CTD y NCP127 (Figuras complementarias 5E-J).

El PDB 4PC0 se utilizó como plantilla inicial para construir RbBP4 en la estructura MuvB-apo en Coot64. LIN9 DIRP, dominio Tudor y dominio medio LIN37 y bucle rico en prolina se construyeron de novo en función de la excelente calidad de nuestro mapa crio-EM. El refinamiento del modelo estructural se realizó con el refinamiento en espacio real PHENIX65 con una resolución de 3,5 Å.

Esta estructura se ajustaba al cuerpo rígido en el mapa complejo MuvBHEAD (Fig. 5B complementaria), donde se podía instalar una hélice retorcida adicional perteneciente al LIN37CTD (residuos 203–246, predichos por AlphaFold51); esto también fue guiado por nuestro XL-MS. datos (Figura 3b). PDB 6C48 se instaló en el mapa MuvBTAIL-NCP (Fig. cyd). La conexión de MuvB HEAD y TAIL a través del bucle LIN9 se modela para mostrar la conectividad entre estos módulos. PDB 6PWE se utilizó como plantilla inicial para modelar el complejo NCP-ADN.

El modelo AlphaFold del subcomplejo LIN9CTD:LIN54CTD se obtuvo enviando los residuos LIN9 421–542 y los residuos LIN54 635–749 a AlphaFold51. La predicción de este subcomplejo tiene una puntuación general alta a juzgar por la prueba de diferencia de distancia local predicha.

Se mezcló NCP o ADN con complejo MuvB o MMB en una proporción de 1:0 (control de entrada) o 1:1, 1:2, 1:4 a menos que se indique lo contrario. La concentración de NCP o ADN fue constante a 0,5 µM. Las reacciones se completaron con tampón que contenía HEPES 20 mM, pH 8, NaCl 50 mM, TCEP 0,5 mM y se incubaron en hielo durante 30 minutos. Después de la adición de sacarosa al 5 % (v/v), las muestras se resolvieron mediante electroforesis en gel utilizando un gel de poliacrilamida con TBE al 5 % o un gel de agarosa con TBE al 1 %. Los geles se tiñeron con SYBR Safe y se escanearon utilizando un generador de imágenes Typhoon FLA 9500 o un sistema Biorad ChemiDoc. La cuantificación se realizó utilizando ImageLab (Biorad). Las intensidades de las bandas de NCP o ADN no unidas se normalizaron con respecto a la intensidad de la banda de NCP o ADN en ausencia del complejo proteico estudiado y se representaron como porcentaje de la fracción de NCP/ADN no unida. Se muestran las medias ± error estándar de la media de al menos tres experimentos independientes.

NCP167 se mezcló con MMBcore a una concentración de 0,5 y 1,25 μM, respectivamente. La mezcla se incubó en hielo durante 15 min. Se tituló H1 hasta la mezcla a una concentración final de 0,25, 0,5 y 0,75 µM. Después de otros 15 minutos de incubación, se añadió sacarosa hasta una concentración final del 5% (v/v) y las muestras se analizaron en gel de TBE-agarosa al 1%. El gel se ejecutó a 100 V durante 3,5 h a 4 °C. El gel se tiñó con SYBR Safe y se escaneó con un generador de imágenes Typhoon FLA 9500.

La secuencia CHR que contenía NCP se mezcló con MuvB a una concentración de 0,5 y 1,5 μM, respectivamente. El péptido LANA se tituló hasta la mezcla a una concentración final de 100, 200 y 300 µM. Después de 15 minutos de incubación, se añadió sacarosa hasta una concentración final del 5% (v/v). Las muestras se analizaron en gel PAGE nativo al 5 %. El gel se ejecutó a 100 V durante 1,5 h a 4 °C. El gel se tiñó con SYBR Safe y se escaneó con un generador de imágenes Typhoon FLA 9500.

De manera similar al protocolo de reticulación descrito anteriormente para apo-MuvB, se incubaron 30 µl de complejo MuvB recién purificado a una concentración de 28 µM con 0,75 µl de DSSO (disuccinimidilsulfóxido) (A33545, Thermo Scientific) predisuelto en DMSO a una concentración de 100 mM. La muestra se incubó en hielo durante 10 minutos y luego se inactivó con 2 µl de Tris 500 mM pH 8 y SEC inmediata en una columna Superose 6 3,2/300 (GE Healthcare) en un tampón que contenía Tris 20 mM, pH 8, NaCl 100 mM, TCEP 0,2 mM. Las fracciones eluidas se analizaron mediante SDS-PAGE y las fracciones que contenían monómero MuvB apropiadas se combinaron y concentraron a 20 µl y se reinyectaron en la columna SEC como se describió anteriormente para eliminar cualquier contaminante de orden superior. La fracción que contenía monómeros se analizó mediante espectrometría de masas como sigue.

Después de la reacción de reticulación, se añadió tampón de bicarbonato de trietilamonio (TEAB) a la muestra a una concentración final de 100 mM. Las proteínas se redujeron y alquilaron con tris-2-carboxietilfosfina (TCEP) 5 mM y yodoacetamida (IAA) 10 mM simultáneamente durante 60 minutos en la oscuridad y se digirieron durante la noche con tripsina a una concentración final de 50 ng/μl (Pierce). La muestra se secó y los péptidos se fraccionaron con cromatografía de fase reversa (RP) de pH alto usando la columna XBridge C18 (2,1 x 150 mm, 3,5 μm, Waters) en un sistema de HPLC Dionex UltiMate 3000. La fase móvil A era hidróxido de amonio al 0,1% v/v y la fase móvil B era acetonitrilo, hidróxido de amonio al 0,1% v/v. Los péptidos se fraccionaron a 0,2 ml/min con el siguiente gradiente: 5 min a 5 % B, hasta 12 % B en 3 min, durante 32 min gradiente a 35 % B, gradiente a 80 % B en 5 min, isocrático para 5 min y reequilibrio al 5 % de B. Se recogieron fracciones cada 42 s, se secó SpeedVac y se agruparon ortogonalmente en 12 muestras para análisis de MS.

El análisis LC-MS se realizó en el sistema UHPLC Dionex UltiMate 3000 junto con el espectrómetro de masas Orbitrap Lumos (Thermo Scientific). Cada fracción de péptido se reconstituyó en 30 µl de ácido fórmico al 0,1 % y se cargaron 15 µl en la columna de captura Acclaim PepMap 100, 100 µm × 2 cm C18, 5 µm a un caudal de 10 µl/min de tampón de carga de ácido fórmico al 0,1 %. Luego, los péptidos se sometieron a una elución en gradiente en la columna capilar C18 Acclaim PepMap (75 μm × 50 cm, 2 μm, 100 Å) conectada a un emisor de acero inoxidable con unión líquida integrada (n.° de catálogo PSSELJ, MSWIL) en el EASY-Spray. fuente a 45°C. La fase móvil A era 0,1% de ácido fórmico y la fase móvil B era 80% de acetonitrilo y 0,1% de ácido fórmico. El método de separación en gradiente a un caudal de 300 nL/min fue el siguiente: durante 95 min gradiente del 5 al 38 % de B, durante 5 min hasta el 95 % de B, durante 5 min isocrático al 95 % de B, reequilibrio al 5 % B en 5 min, durante 10 min isocrático al 5% B. Los precursores entre 375 y 1600 m/z y carga igual o superior a +3 se seleccionaron a una resolución de 120.000 en el modo de velocidad máxima en 5 segundos y se aislaron para la fragmentación CID ( energía de colisión 25%) con ancho de aislamiento cuadrupolo 1,6 Th y detección Orbitrap con resolución 30.000. Los fragmentos con una diferencia de masa objetivo de 31,9721 (entrecruzador DSSO) se sometieron además a fragmentación CID en el nivel MS3 con energía de colisión del 35%, detección de trampa de iones, IT máximo 50 ms, AGC 2 × 104 y ventana de aislamiento MS2 2 Th. Se seleccionaron dos grupos precursores con ambos iones en el par. Los precursores de MS específicos se excluyeron dinámicamente para su posterior aislamiento y activación durante 30 s con una tolerancia de masa de 10 ppm.

La identificación de péptidos entrecruzados se realizó en Proteome Discoverer 2.4 (Thermo) con el motor de búsqueda Xlinkx en el modo MS2_MS3. Las tolerancias de masa del precursor, FTMS e ITMS fueron de 20 ppm, 30 ppm y 0,5 Da respectivamente, permitiéndose un máximo de 2 escisiones omitidas por tripsina. Se seleccionaron carbamidometilo en C y oxidación en M como modificaciones estáticas y dinámicas respectivamente. Se buscaron espectros en un archivo FASTA que contiene las secuencias de las proteínas en el complejo, así como una selección aleatoria de ~1000 entradas UniProt de Escherichia coli como control negativo adicional de las coincidencias de entrecruzamiento. Los péptidos reticulados se filtraron a FDR <0,01 utilizando el nodo Percolator y la búsqueda en la base de datos señuelo.

Dada la alta flexibilidad entre MuvBHEAD y MuvBTAIL (Figura complementaria 4F), los enlaces cruzados entre estos dos módulos se excluyeron de la interpretación estructural (Figura complementaria 6B y Datos complementarios 1).

Más información sobre el diseño de la investigación está disponible en el Resumen de informes de investigación de la naturaleza vinculado a este artículo.

Los datos que respaldan este estudio están disponibles del autor correspondiente previa solicitud razonable. Las coordenadas estructurales y los datos EM se han depositado en el Protein Data Bank y en el Electron Microscopy Data Bank con los siguientes números de acceso: el complejo apo MuvB (incluido LIN9 DIRP y tudor, RbBP4 y LIN37 MD-PRL) está depositado en PDB -ID 7R1D, EMD-14239. Los mapas EM complejos de MMBcore:NCP están depositados en EMD-15709. Los datos de proteómica de espectrometría de masas se depositaron en el Consorcio ProteomeXchange a través del repositorio de socios PRIDE66 con el identificador de conjunto de datos PXD031421. Los datos originales se proporcionan con este documento.

Se ha publicado una corrección a este artículo: https://doi.org/10.1038/s41467-023-36061-7

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Agradecemos a Basil J. Greber por sus invaluables consejos sobre el procesamiento de datos y la recopilación de la estructura compleja apo MuvB. Agradecemos a Chris Richardson por el excelente soporte de TI. Agradecemos a Thangavelu Kaliyappan por compartir construcciones de expresión de histonas. Agradecemos a Stephen Hearnshaw por su ayuda con la fotometría de masas. Agradecemos a Michael Ranes y Sebastian Guettler por su ayuda con SEC-MALS. Agradecemos a Ruth Knight por ayudar con el cultivo de células de insectos. Agradecemos a Alex Radzisheuskaya, Basil J. Greber y Alessandro Vannini por leer y comentar críticamente este manuscrito. Agradecemos a David Barford por las discusiones y por permitir que CA inicie este proyecto en su laboratorio. Agradecemos a Diamond por el acceso y el apoyo a las instalaciones crio-EM en el Centro nacional de bioimágenes electrónicas (eBIC) del Reino Unido, propuesta BI21809-34, financiada por Wellcome Trust, MRC y BBSRC. Agradecemos al contacto local de eBIC, Yuewen Sheng, por su gran ayuda en la recopilación de los conjuntos de datos MMBcore:NCP. Agradecemos a Christos Savva y al Instituto de Biología Estructural y Química de Leicester (Universidad de Leicester) por su gran ayuda en la recopilación de datos preliminares sobre este proyecto. MGK y CA cuentan con el apoyo de la beca Sir Henry Dale 215458/Z/19/ZRM cuenta con el apoyo del Instituto de Investigación del Cáncer (ICR), el número de subvención asignado es GFR146X. El trabajo de TIR y JSC fue financiado por la subvención del Centro CRUK con número de referencia C309/A25144.

Estos autores contribuyeron igualmente: Marios G. Koliopoulos, Reyhan Muhammad.

División de Biología Estructural, Laboratorios Chester Beatty, Instituto de Investigación del Cáncer, Londres, Reino Unido

Marios G. Koliopoulos, Reyhan Muhammad, Fabienne Beuron y Claudio Alfieri

Proteómica Funcional, Laboratorios Chester Beatty, División de Biología del Cáncer, Instituto de Investigación del Cáncer, Londres, Reino Unido

Theodoros I. Roumeliotis y Jyoti S. Choudhary

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CA clonó y reconstituyó una construcción MuvB inicial que fue optimizada aún más por MGKMGK, reconstituyó todos los complejos MuvB que se muestran en este manuscrito y realizó ensayos bioquímicos y biofísicos. RM reconstituyó nucleosomas y complejos de nucleosomas con complejos MuvB, realizó ensayos bioquímicos y GraFIX. FB preparó rejillas de una construcción inicial del complejo MuvB y encontró una condición inicial para las preparaciones de rejillas crio-EM del complejo apo MuvB. Esta condición se optimizó aún más mediante rejillas crio-EM preparadas por CA, MGK y RMMGK del complejo apo MuvB. RM y MGK prepararon rejillas del complejo MMBcore:nucleosoma. CA coordinó el proceso de EM, examinó las rejillas de crio-EM, recopiló datos de crio-EM y procesó los datos de crio-EM. CA realizó la interpretación y construcción del modelo estructural con aportes de MGK y RMTIR y JSC realizó y supervisó el análisis de MS de la muestra de apo MuvB, respectivamente. CA dirigió el proyecto y diseñó experimentos con MGK y RMCA preparó el manuscrito y lo escribió con la ayuda de MGK y RM.

Correspondencia a Claudio Alfieri.

Los autores declaran no tener conflictos de intereses.

Nature Communications agradece a los demás revisores anónimos por su contribución a la revisión por pares de este trabajo. Los informes de revisión por pares están disponibles.

Nota del editor Springer Nature se mantiene neutral con respecto a reclamos jurisdiccionales en mapas publicados y afiliaciones institucionales.

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Reimpresiones y permisos

Koliopoulos, MG, Muhammad, R., Roumeliotis, TI et al. La estructura de un complejo de factor de transcripción MuvB unido a un nucleosoma revela la remodelación del ADN. Nat Comuna 13, 5075 (2022). https://doi.org/10.1038/s41467-022-32798-9

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Recibido: 23 de febrero de 2022

Aceptado: 15 de agosto de 2022

Publicado: 29 de agosto de 2022

DOI: https://doi.org/10.1038/s41467-022-32798-9

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